حيوانات آزمايشگاهي

در این تحقیق از رتهای سفید نژادwistar استفاده شد .  این حیوانات در سن
 3 ماهگی و وزن تقریبی ۲۵۰ تا ۳۰۰ گرم از موسسه ی سرم سازی رازی مشهد تهیه شدند . تعداد حیوانات استفاده شده در این تحقیق ۴۸ عدد رت نر بود که در ۸ گروه
 6 تایی به صورت زیر تقسیم شدند . البته در طول تحقیق یکی از رت ها از بین رفت و کار با ۴۷ رت ادامه یافت که شامل یک گروه ۵ تایی و هفت گروه ۶ تایی بودند .
۱- گروه کنترل : سالم و دست نخورده
۲- گروه شم : ایجاد ضایعه ی کمپرسیون عصب سیاتیک در پای چپ و تجویز سرم فیزیولوژیک
۳- گروه تجربی ۱ : ایجاد ضایعه ی کمپرسیون عصب سیاتیک پای چپ و سه بار تزریق محلول سیلیکات سدیم
۴- گروه تجربی ۲ : ایجاد ضایعه ی کمپرسیون و سه بار تزریق عصاره ی گیاه دم اسب.
۵-گروه تجربی ۳ : ایجاد ضایعه ی کمپرسیون عصب سیاتیک پای چپ و شش بار تزریق محلول سیلیکات سدیم
۶- گروه تجربی ۴ : ایجاد ضایعه ی کمپرسیون عصب سیاتیک پای چپ و شش بار تزریق عصاره ی گیاه دم اسب
۷- گروه تجربی ۵ : ایجاد ضایعه ی کمپرسیون عصب سیاتیک پای چپ و نه بار تزریق محلول سیلیکات سدیم
۸- گروه تجربی۶: ایجاد ضایعه ی کمپرسیون عصب سیاتیک پای چپ و نه بار تزریق عصاره ی گیاه دم اسب

 

جمع آوری گیاه دم اسب و نحوه ی  عصاره گیری آن :
گیاه دم اسب مورد استفاده از این تحقیق از منطقه سیاهرود گرگان جمع آوری و ساقه ها و برگهای گیاه جدا و پس از خشک شدن به صورت پودر درآورده شدند .   چون در طب سنتی برای تامین اثرات ترمیمی آن در انسان روزانه شش کپسول۳۶۰ میلی گرمی از پودر گیاه دم اسب توصیه شده است مقدار مورد نیاز روزانه برای یک رت ۳۰۰ گرمی برابر ۹۶/۱۲ محاسبه شد و چون تزریقات هر سه روز یکبار انجام می شد مقدار لازم برای این مدت ۸۸/۳۸ محاسبه شد .

مقدار پودر لازم برای انسان در هر روز : ۳۶۰ × 6 = 2160 میلی گرم
مقدار پودر لازم برای رت ۳۰۰ گرمی : ۹۶/۱۲ میلی گرم
مقدار پودر لازم برای سه شبانه روز : ۹۶/۱۲ × 3 = 88/38

به طور قرار دادی میزان تزریق محلول به هر رت ۳۰۰  گرمی یک سی سی در نظر گرفته شد و چون رتهای دریافت کننده در این تحقیق به سه گروه شش تایی تفکیک شده بودند که گروه اول سه بار ، گروه دوم شش بار و گروه سوم نه بار عصاره ی گیاه دم اسب دریافت کردند . از این رو حجم لازم از عصاره ی گیاه دم اسب ۱۰۸سی سی محاسبه شد.

سی سی   108 =  (3 × 6) + (6×6) + (9×6)
جهت احتیاط حجم لازم عصاره ۱۳۰ سی سی در نظر گرفته شد و میزان لازم از پودر ساقه ی دم اسب برای تهیه ی ۱۳۰ سی سی عصاره ۰۵۴/۵ میلی گرم محاسبه شد . چون برای تهیه ی هر یک سی سی مقدار ۸۸/۳۸ میلی گرم پودر مورد نیاز است .                                            
گرم ۰۵۴/۵ = ۵۰۵۴=  88/38 × 130

برای عصاره گیری از برگ و ساقه ۵ گرم از هر یک از پودرها در ۳۵۰ سی سی آب مقطر ریخته شد  و روی حرارت قرار گرفت بعد از این که محلول خوب جوشید و کمی غلیظ شد آنرا به صورت کاغذ صافی ، صاف کرده و با افزودن آب مقطر حجم محلول زیر کاغذ صافی به ۱۳۰ سی سی رسانده شد .
سپس pH عصاره به کمک دستگاه pH متر اندازه گیری شد .  گیاه دم اسب به علت وجود ترکیبات اسیدی مختلف دارای ماهیت اسیدی است که مقدار آن با دستگاه
 pH متر ۶۶/۴ اندازه گیری شد و برای خنثی سازی pH اسیدی عصاره از سود نرمال استفاده شد .   یعنی محلول سود به صورت قطره قطره استفاده گردید تا pH به ۴/۷ برسد .   
 پس از تهیه ی عصاره ی برگ و ساقه ی دم اسب میزان ترکیبات سیلیس موجود در عصاره ها به کمک دستگاه اسپکترومتری جذب اتمی (در شعله ی استیلن و اکسید نیترو C2 H2 , N2O) در آزمایشگاه شیمی تجزیه اندازه گیری شد .   نتایج حاصل در جدول زیر ارائه شده است .

جدول ۱ – میزان ترکیبات سیلیسی موجود در عصاره ی گیاه دم اسب :
نمونه    Si (ppm)    SiO2 (ppm)    SiO32-  (ppm)
عصاره ی ساقه    03/41    79/87    16/111
عصاره ی برگ    69/5    18/12    94/14

با توجه به اطلاعات ارائه شده در جدول مشخص می شود که میزان ترکیبات سیلیس دار موجود در ساقه ی گیاه دم اسب بیشتر از میزان این ترکیبات در برگ گیاه است .  لذا در این تحقیق از ساقه ی گیاه دم اسب استفاده شده چون در نمونه ی مورد بررسی پنج گرم پودر ساقه ی دم اسب جوشانده شده و به حجم ۱۳۰ سی سی رسانده شد  لذا میزان سیلیکات محلول در آن برابر  4- 10 × 16 /2890% بدست آمد .   برای تعیین میزان ماده ی خشک موجود در عصاره ی ساقه ۱۰ سی سی از این محلول روی فویل آلومینیومی ریخته شد و در آون ۵۰ درجه ی سانتیگراد خشک شد و در نهایت از اختلاف وزن فویل خالی و فویل دارای ماده ی خشک ، میزان ماده ی خشک در
 10 سی سی برابر با ۵/۴۵ میلی گرم محاسبه شد .   لذا دوز مورد استفاده برابر
 15  میلی گرم ماده ی خشک بر کیلوگرم وزن رت بدست آمد .
در منابع مختلف ، دوز های تجویزی عصاره ی ساقه ی گیاه دم اسب
 10 تا۴۰۰ میلی گرم ماده ی خشک بر کیلوگرم وزن رت متفاوت است .

تهیه ی محلول سیلیکات :
برای این منظور نمک متا سیلیکات سدیم تهیه شد(َ   .(Aldrich chemical company در منابع مختلف میزان تجویز متا سیلیکات سدیم ۲ تا ۴۰ میکرو گرم بر هر گرم غذای رت می باشد . اگر هر رت روزی ۱۵ گرم به طور متوسط غذا مصرف کند میزان دوز دریافتی ۶۰۰ میکرو گرم خواهد بود و چون در این تحقیق هر سه روز یکبار تزریق انجام می شود لذا۱۸۰۰ میکروگرم یا ۸/۱ میلی گرم محاسبه و در ۱ سی سی آب مقطر حل شد .
PH محلول سیلیکات سدیم تهیه شده توسط دستگاه pH متر معادل ۶۰/۱۳ بدست آمد که علت قلیایی بودن pH محلول سیلیکات سدیم این است که وقتی متا سلیکات سدیم در آب حل می شود به دو یون Na + و ۲ –  SiO3  تجزیه می شود . یون سدیم یا یون هیدروکسید (oH-) آب ترکیب و Na oH که یک باز قوی است را تولید می کند در حالی که یون سیلیکات با یون H+ واکنش داده و H2sio3 که اسید ضعیفی است را به وجود می آورد برای خنثی کردن pH محلول سیلیکات سدیم از اسید کلرید ریک نرمال استفاده شد .

روش جراحی حیوانات آزمایشگاهی :
ابتدا حیوانات به وسیله ی تزریق داخل صفاقی کتامین (۷ میلی گرم / کیلوگرم) و رامپون (۹۰ میلی گرم / کیلوگرم) بیهوش گردیدند ، سپس حیوان را به پهلوی راست خوابانده و به کمک تیغ ناست موهای پوست ناحیه ی سر استخوان ران را تراشیده و سپس محل مورد نظر با محلول بتادین ضد عفونی شد ، آنگاه در زیر سر استخوان ران برش در پوست به طول یک سانتیمتر ایجاد کرده و سپس عضلات موجود را کنار زده تا عصب سیاتیک آشکار شود برای اعمال کمپرسیون عصب از پنس قفل دار ساده استفاده شد . و عصب سیاتیک به مدت ۳۰ ثانیه تحت کمپرسیون قرار گرفت .
روش اعمال کمپرسیون در همه ی رت ها یکسان و از پنس قفلدار یکسانی استفاده شد .  بعد از انجام کمپرسیون عصب سیاتیک را به آرامی در محل طبیعی خود قرار داده و لبه های زخم به وسیله ی گیره های مخصوص به همدیگر بخیه زده شدند و سپس محل زخم توسط محلول بتادین ضد عفونی شد .
نحوه ی تزریق و میزان تزریق عصاره ی گیاه دم اسب و متا سیلیکات :
برای تزریق محلول های مورد نظر از روش درون صفاقی استفاده شد و بطور قراردادی میزان تزریق محلول به هر رت ۳۰۰  گرمی یک سی سی در نظر گرفته شد و برای رتهای دیگر به وزنهای متفاوت میزان تزریق بر این اساس محاسبه شد .
به رتهای گروه تجربی ۱،  سه بار محلول سیلیکات سدیم تزریق شد و به گروه تجربی ۳ شش بار تزریق محلول فوق و به رتهای گروه تجربی ۵، نه بار از محلول فوق تزریق شد . همچنین به رتهای گروه تجربی۲ ، سه بار عصاره ی گیاه دم اسب و به رتهای گروه تجربی۴ ،  شش بار تزریق عصاره ی گیاه دم اسب و به رتهای گروه تجربی ۶ ، نه بار عصاره ی گیاه دم اسب تزریق شد .
اولین نوبت تزریق بلافاصله بعد از انجام کمپرسیون عصب سیاتیک انجام شد و فاصله ی زمانی بین تزریقها ، سه شبانه روز یا ۷۲ ساعت در نظر گرفته شد .

نحوه ی نمونه برداری :
پس از گذشت یک ماه از زمان کمپرسیون ، کمپرسیون عصب و طی مراحل تزریق عصاره با متاسیلیکات سدیم ابتدا رت ها را با فرمالین ۱۰ درصد پرفیوژن قلبی کرده و کلیه ی امحاء و احشا حفره ی شکمی و قفسه ی سینه ی جانور را خالی کرده و سپس با ایجاد برش در استخوان جمجمه و نخاع گردنی مغز جانور همراه با قسمت کوچکی از نخاع گردنی متصل به آن جدا شد . سپس نمونه ها برای کامل کردن عمل تثبیت به داخل شیشه های درب دارد محتوی فرمالین ۱۰ درصد خنثی منتقل شده و روی شیشه ها اطلاعات مربوط به شماره ی حیوان و تاریخ نمونه برداری ثبت شد .

پاساژ بافتی :
  مراحل پاساژ بافتی که در این تحقیق انجام شد به ترتیب شامل مراحل زیر است :
۱- قرار دادن نمونه در فیکساتور
۲- آبگیری با الکل
۳- شفاف کردن
۴- آغشتگی به پارافین
۵- قالب گیری
در مرحله ی اول نمونه های به مدت یک هفته در محلول فیکساتور نگهداری شده اند تا به طور کامل فیکس شوند و سپس مراحل آبگیری بافت به شرح زیر انجام شد :
– قرار دادن نمونه در الکل ۷۰ درصد حداقل ۱۲ ساعت
– قرار دادن نمونه در الکل ۸۰ درصد حداکثر ۱۲ ساعت
– قرار دادن نمونه در الکل ۹۰درصد حداکثر ۱۲ ساعت
– قرار دادن نمونه در الکل ۱۰۰ درصد حداکثر ۱۲ ساعت
در مرحله ی سوم برای شفاف کردن بافت ، نمونه ها به مدت ۴ تا شش ساعت در بوتانول قرار داده شده اند . در مرحله ی چهارم بعد از شفاف سازی ،  نمونه ها در داخل پارافین مذاب در  درجه ی ۶۰ – 58 درجه ی سانتیگراد قرار گرفتند و برای نفوذ پارافین به بافت ۶ ساعت زمان در نظر گرفته شد .
در آخرین مرحله برای قالب گیری از قالبهای آلومینیومی استفاده شد به این ترتیب که ابتدا قالب را روی سطحی صاف گذاشته و در آن پارافین مذاب ریخته و سپس به کمک یک پنس گرم ، نمونه را از داخل آنکوباتور خارج کرده و در وسط قالب به آرامی قرار داده شد .

برش گیری :
عمل برش زدن نمونه به وسیله ی میکروتوم انجام شد.   ضخامت برشها ۷ میکرون
در نظر گرفته شد و از بین هر ۵۰ برش یک جفت برش انتخاب شده و به داخل حمام آب گرم منتقل شدند تا چین و چروکهای آنها کاملاً باز شود.   سپس برشها را روی لام قرار داده و لامها به ترتیب شماره گذاری شدند .

رنگ آمیزی :
چون یکی از خصوصیات سلولهای عصبی وجود اجسام نیسل می باشد و این اجسام به وسیله ی رنگهای بازی در بافرهای خاص رنگ می گیرند برای رنگ آمیزی برشها از رنگ آبی تولوئیدین استفاده شد مراحل انجام شده برای رنگ آمیزی به شرح
زیر است :
۱- قرار دادن لامها در زایلن برای حذف کامل دانه های پارافین از نمونه
۲- آب دهی برشها با قرار دادن آنها به ترتیب ، در الکل ۱۰۰% – الکل ۹۰%
 الکل ۸۰% – الکل ۷۰% – الکل ۵۰% – آب مقطر (زمان لازم برای هر مرحله
 3 تا ۵ دقیقه) .
۳- وارد کردن لامها در محلول A که حاوی آبی تولوئیدین می باشد به مدت ۱۰ دقیقه.
۴- شستشوی لامها به وسیله ی محلول تامپون B .
۵- عبور دادن نمونه ها از الکل ۹۶ درجه جهت حذف رنگ اضافه و ایجاد کنتراست بهتر .
۶- وارد کردن لامها در ظرف حاوی مولیبیدات آمونیوم ۴% آبکی به مدت ۱۰ دقیقه (این عمل برای تثبیت رنگ انجام می شود)
۷- شستشوی نمونه ها با آب جاری  .
۸- رنگ آمیزی ماتریکس سلولی به وسیله ی اریتوزین ۱ % به مدت ۱ تا ۲ ثانیه .
۹- شستشو با الکل ۹۶ درجه .
۱۰- شفاف کردن نمونه ها با زایلن .
۱۱- چسباندن لامل روی نمونه ها با استفاده از چسب انتلان .
لازم به تذکر است که محلول A و B شامل ترکیبات زیر است :

                اسید استیک نرمال ۱ سی سی
ترکیب محلول A :        استات سدیم نرمال ۱ سی سی
                آب مقطر ۹۸ سی سی
                آبی تولوئیدین ۰۶۴/۰ گرم
               

                                       اسید استیک ۱ سی سی
ترکیب محلول B:    ‌‌‌‌‌    استات سدیم ۱ سی سی    
                آب مقطر ۹۸ سی سی

در ضمن pH محلول A باید ۶۵/۴ باشد چون اجسام نیسل در این pH بطور اختصاصی رنگ می گیرند .

عکس برداری از نمونه ها :
پس از رنگ آمیزی ، لام های مربوط به هر نمونه به ترتیب شماره مرتب و از آنها با دوربین دیجیتال قابل نصب بر روی میکروسکوپ عکس گرفته شد.   از هر برش موجود بر روی لام یک عکس کلی با عدسی شیئی ۵ و عدسی چشمی ۱۰ گرفته شد و سپس چهار قطعه عکس به ترتیب از نیمه چپ برش اول و نیمه چپ برش دوم و نیمه راست برش اول و نیمه راست برش دوم با درشت نمایی چشمی ۴۰ گرفته شد .
برای تعیین درشت نمایی کلی عکسها از لام میکرومتری استفاده شد.   به این ترتیب که این لام را زیر میکروسکوپ قرار داده و یک بار با عدسی چشمی ۵ و یکبار با عدسی چشمی ۴۰ از آن عکس گرفته شد تا از روی میزان بزرگ شدن آن ، درشت نمایی عکسها محاسبه شود .
 
شمارش نورونها :
در این تحقیق از روش نمونه برداری سیستماتیک رندوم استفاده شد و برای شمارش ذرات که همان نورنها و سلول های گیاهی موجود در هسته های گراسیلی می باشند از روش دایسکتور استفاده شد.  دایسکتور روشی است که در آن جزئیات نمونه ها در یک فضای سه بعدی بدون در نظر گرفتن اندازه و یا شکل آنها شمارش می شوند .   در این روش دو برش باید دارای وضعیت یکسانی در فضای مرجع باشند که فضای مرجع دارای ذرات مورد نظر است . ]۱۸[
دایستکتور شامل دو برش موازی است که با فاصله ی مشخص از یکدیگر قرار گرفته اند و ذرات واقع در چارچوب مرجع شمارش می شوند.   اگر ذره ای در داخل چارچوب مرجع واقع بر روی برش اول باشد ولی در چهارچوب واقع در برش دوم نباشد یعنی نوک ذره در فضای بین دو برش باشد در شمارش به حساب می آید ولی اگر ذره مورد نظر در هر دو برش مشاهده شود در شمارش به حساب نمی آید به این ترتیب فقط نوک ذرات شمارش می شوند . (شکل ۵-۱)
در متد دایستکتور باید فاصله ی بین دو برش از اندازه کوچکترین ذره مورد شمارش کمتر باشد چون در غیر این صورت ممکن است ذره در فاصله ی بین دو برش قرار گرفته و در شمارش به حساب نیاید .
فضای مرجع از حاصل ضرب مساحت چهارچوب در فاصله ی بین دو برش
بدست می آید .  اگر چنانچه ذراتی روی خطوط چهارچوب قرار گیرند،  بطور قرار دادی ذرات واقع بر روی دو خط منقطع را شمارش کرده و ذرات واقع بر روی دو خط دیگر را نمی شماریم .
در روش دایسکتور برای بررسی یافته های خام حاصل از شمارش نورونها به پارامترهای زیر نیازمندیم :
  : مجموع نورنهای شمارش شده در یک نمونه
  : مجموع دفعات نمونه برداری (تعداد چهارچوب های استفاده شده)
V dissector : حجم فضای نمونه برداری شده که عبارت است از :
V dissector = A frame × h
که در این رابطه  Aframe  مساحت نمونه برداری و h فاصله ی بین دو برش
می باشد .
برای بررسی آماری یافته ها و انجام تستهای آماری در بین گروهها به پارامتر دیگری بنام  دانسیته ی تعداد (NV) یا numerical density نیز نیاز داریم که این پارامترها از رابطه ی زیر محاسبه می شود :                                                                           
 NV =