قارچ خوراکی(تهیه نژادها)

A15-6    MC392-17    MC378-53    130-7    MC370-60
A15-8    MC392-14    MC378-59    130-41   
A15-10               

در ابتدا برای حفظ تازگی از هموکاریونها زیر کشت گرفتیم.

روش تهیه محیط کشت غذایی PDA: (Potato Dextrose Agar)
محیط کشت PDA شامل سیب‌زمینی، قند دکستروز و آگار است و به عنوان یک محیط غذایی کامل و ساده به شمار می‌رود. میسلیوم‌های قارچ خوراکی به راحتی در آن رشد می‌کنند. به صورت فرمولاسیون پودر وتابل، در بازار موجود است. در این تحقیق به منظور کاهش هزینه‌ها و نیز بدست آوردن و بکارگیری یک روش تهیه محیط غذایی، PDA به صورت دست ساز تهیه شد، که بسیار مناسب و مقرون به صرفه بود. روش تهیه PDA دست‌ساز این گونه است که ابتدا، ۳۰۰ گرم سیب‌زمینی پوست شده را خرد کردیم و به قطعات کوچک در آوردیم و در یک لیتر آب مقطر به مدت یک ساعت جوشاندیم پس از عصاره‌گیری، دو مرتبه از کاغذ صافی عبور داده تا هیچ پورهء سیب‌زمینی، در عصاره نباشد. سپس، به ازاء هر یک لیتر محیط کشت، ۲۰ گرم آگار و ۱۰ گرم قند دکستروز اضافه کردیم و با همزن مغناطیسی به مدت ده دقیقه مخلوط ‌کردیم، تا رنگ محلول کاملاً شفاف شد. سپس، محلول را به مدت ۱۸ دقیقه در فشار ۴/۱ اتمسفر و دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد در اتوکلاو سترون (استریل) کردیم. اگر زمان سترون کردن بیش از زمان تعیین شده باشد، خواص ماده غذایی کم می‌شود و همچنین در صورت کم بودن دما و کاهش زمان استریل کردن، عمل سترون ناقص انجام می‌شود و در مراحل بعد، آلودگی باعث کندی روند کار می‌شود. مراحل بعدی کار در محیط کاملاً استریل و در زیر هود انجام می‌گیرد. پس از تهیه PDA دست ساز، در هر پتری دیش (قطر ۱۰ سانتیمتر) حدود ۲۰ میلی‌لیتر از محیط کشت ریختیم. پتری دیش‌ها یک بار مصرف بودند و قبلاً گاما استریل شده بودند. بعد از مدت یک ساعت کاملاً سرد و محیط کشت جامد تهیه شد.

روش کشت هموکاریونها:
پس از تهیه محیط کشت غذایی، زمان واکشت از  هموکاریونها بود تا آنها تازگی خود را بدست آورند. در زیر هود، تمام ابزار و وسایل را با الکل ۹۶ درصد استریل کردیم. تیغ و دسته آن نیز به مدت ۲ ساعت در آون با دمای ۱۵۰درجه سانتیگراد، سترون شد. از میسلیوم هموکاریون، قطعه‌ای جدا کرده و به محیط کشت جدید، منتقل کردیم. بر روی برچسب درب پتری، تاریخ کشت، نژاد و نوع محیط کشت درج شد. سپس، درب پتری دیش با پارافیلم بست شد و در دمای   درجه سانتیگراد نگه‌داری شد.  میسلیوم‌ها در محیط کشت رشد کرده و از محیط غذایی استفاده کردند. پس از ۲۵ روز، سطح محیط کشت از میسلیوم پر شد. این پتری دیش‌ها را می‌توان در یخچال، در درجه حرارت ۵ درجه سانتیگراد به مدت دو ماه، نگه‌داری کرد و پس از آن مجدداً برای حفظ تازگی، باید واکشت گرفته شود.
 
روش تلاقی نژادهای هموکاریون:
با ده ایزوله هموکاریون که به صورت تازه تهیه شده بودند، ۴۵ تلاقی دو به دو بدست آمد.
 
برای دورگ‌گیری، ابتدا محیط کشت PDA به صورت دست‌ساز به تعداد کافی تهیه شد. در زیر هود، دو قطعه از دو نژاد مختلف را به فاصله ۲ـ۱ سانتیمتر در محیط کشت قرار دادیم. ظرف پتری که حاوی هر دو نژاد بود را در محیطی با دمای   درجه سانتیگراد قرار دادیم، تا میسلیوم‌های هر دو نژاد، رشد کنند و به یکدیگر برسند و تلاقی صورت بگیرد. از علائم بارز ، که نشان دهنده تلاقی موفق دو نژاد است، رشد میسلیوم‌های هوایی در منطقه تلاقی دو نژاد و رشد ناگهانی و سریع منطقه تلاقی است.

 
نمونه‌گیری از منطقه تلاقی:
از منطقه تلاقی دو نژاد، که رشد سریع‌تری داشت، قطعاتی برداشتیم و به محیط کشت جدیدی که تهیه شده بود، منتقل کردیم. این قطعه در اصل همان هیبرید (دو رگ) حاصل از تلاقی دو نژاد است. سپس در محیطی با دمای   درجه سانتیگراد قرار دادیم، تا رشد کنند. پس از حدود ۲۰ روز که رشد میسلیوم‌های دو رگ در محیط کشت به حد کافی رسید، یک واکشت مجدد، برای به خلوص رساندن هیبرید، انجام شد. باید توجه داشت که واکشت‌های گرفته شده از میسلیوم‌های تازه رشد کردهء محیط کشت باشد و نیز دقت کافی در تلاقی‌ها، مانع آلودگی‌های باکتریایی و قارچی در محیط غذایی شده و سرعت کار بالا می‌رود.
در هر پتری، سه نمونه از هیبرید در قسمت میانی محیط کشت و در دو طرف آن‌، از دو والد هموکاریون، نمونه‌هایی گذاشته شد تا در مرحله رشد، بین میسلیوم‌های والدین و هیبرید مقایسه صورت گیرد.

تهیه اسپاون مادری از هیبریدها:
اصطلاح اسپاون به رشد رویشی میسلیوم قارچ خوراکی بر روی ماده غذایی زمینه‌ای (مانند دانه غلات) اطلاق می‌شود. این ماده غذایی زمینه، می‌تواند دانه‌های گندم، چاودار، ارزن، سروگوم یا جو باشد که در حقیقت باعث تغذیه میسلیوم‌ها، می‌شود. برای تهیه اسپاون یک کیلوگرم گندم را با ۱۵۰۰ میلی‌لیتر آب به مدت ۲۰ دقیقه جوشاندیم. در زمان جوشاندن، عمل هم زدن گندم‌ها صورت گرفت. پس از جوشاندن، به مدت ۱۰ دقیقه گندم‌ها را در آب خیساندیم. سپس، گندم‌ها را با آب سرد شستشو دادیم و بر روی کاغذ صافی پهن کردیم تا سرد شوند و رطوبت سطحی گندم، از بین برود. به ازاء هر یک کیلوگرم گندم میزان ۱۲ گرم کربنات کلسیم  (آهک) برای تنظیم pH  همچنین ۶ گرم سولفات کلسیم (گچ) برای جلوگیری از لزج شدن و به هم چسبیدگی گندم‌ها اضافه شد. رطوبت نسبی دانه‌ها در حدود ۵۳% بود.
حدود   حجم ظروف شیشه‌ای را،  با گندم آماده شده، پر کردیم و   باقیمانده از شیشه‌ها را خالی گذاشتیم. درب شیشه‌ها را با ورق آلومینیوم بستیم و به اتوکلاو منتقل کردیم. اتوکلاو  با درجه حرارت ۱۲۱ درجه سانتیگراد و فشار ۴/۱ اتمسفر به مدت ۵/۱ ساعت، تنظیم شد و پس از استریل کردن گندم‌ها، شیشه‌ها را در محیط دور از آلودگی، به مدت ۲۴ ساعت قرار دادیم تا سرد شوند. استریل ناقص عامل مهم در ایجاد آلودگی ماده زمینه‌ای محسوب می‌شود.

تلقیح دانه‌های گندم با کشت هیبرید:
در زیر هود، که فضای آن کاملاً استریل بود، قطعه‌ای از کشت هیبرید، به قطر یک سانتیمتر برداشته و داخل ظرف شیشه‌ای قرار دادیم. بهتر است که دو قطعه کشت هیبرید به هر شیشه منتقل شود، زیرا اسپاون سریع‌تر تهیه می‌شود. ۴۵ نوع کشت هیبرید داشتیم که ۴۵ شیشه اسپاون نیز تهیه شد. سپس تمام شیشه‌ها را به محیطی با درجه حرارت   درجه ‌سانتیگراد،  منتقل کردیم. پس از چند روز، رشد میسلیوم‌ها در دانه‌های گندم دیده شد. میسلیوم‌ها رشد کرده و دانه‌های گندم را فرا گرفت و رنگ سفید دانه‌ها به وضوح دیده می‌شد. هر چند روز یک بار، با آرامش شیشه‌ها را تکان دادیم تا انتشار و توسعه میسلیوم‌ها به راحتی انجام شود. حدود ۲۵ روز طول کشید تا اسپاون تهیه شد.

تهیه بستر کشت (کمپوست):
بستر کشت یا همان کمپوست یک محیط مناسب برای قارچ است، که می‌تواند مواد غذایی مورد نیاز در طول دوره‌ رشد را، برای قارچ فراهم کند. برای تهیه کمپوست، ابتدا هشت بسته کاه، به طور کامل خیسانده شد و یک روز در هوای آزاد رها شد تا کامل آب جذب کند. روز بعد توده کاه به هم زده شد. سپس عمل قالب‌زنی انجام شد، به این نحو که، کاه و کلش در سطحی به طول یک متر و عرض ۵/۱ متر پهن شد و لایه به لایه به کاه و کلش، مخلوط کود مرغی به میزان ۶۰ کیلوگرم، اوره ۲ کیلوگرم، ملاس چغندر قند به میزان یک کیلوگرم و گچ چهار کیلوگرم اضافه شد. در هر لایه سعی شد، مواد موجود خوب با هم مخلوط شوند. پس از پایان قالب زنی، ارتفاع قالب به یک و نیم متر رسید. توده قالب زده شده، پنج روز باقی می‌ماند تا فعالیت میکروارگانیزم‌های آن شروع شود و تخمیر کاه و کلش صورت گیرد. دمای مرکز توده به ۸۰ – 75 درجه سانتیگراد رسید.  تهیه کمپوست، ۲۵ روز طول کشد و هر پنج روز یکبار همزنی،‌‌ آبیاری قستمهای خشک و قالب زنی مجدد، صورت گرفت. هم زدن، باعث می‌شود تا اکسیژن لازم برای فعالیت میکروارگانیزم‌های هوازی فراهم شود و گاز آمونیاک تولید شده، خارج شود. پس از دومین و سومین قالب زنی، دیگر نیازی به آبیاری نبود و فقط همزدن انجام شد. به قسمتهایی از کمپوست که حالت لزج داشت، گچ اضافه گردید. پس از پنجمین قالب زنی و فرم دادن کمپوست،  زمان رسیدگی کمپوست است، که بوی علف تازه و رنگ قهوه‌ای تیره کمپوست نشانه آن است . اگر مقداری کمپوست را در دست فشرده کنیم دوباره به حالت اول باز می‌گردد که نشان از یک کمپوست مناسب کاملاً آماده است.
 
الف ـ پاستوریزاسیون و آمونیاک زدایی:
 پاستوریزاسیون از طریق گردش بخار آب داغ در اتاق پاستوریزاسیون صورت گرفت و دمای کمپوست به ۶۰ درجه سانتیگراد رسانده شد. پس از ۸ ساعت، اجازه داده شد کمپوست خنک شود. و آمونیاک اضافی از آن حذف شود. ضمناً جریان بخار آب داغ، موجب از بین رفتن آفات و بیماریها و اسپور قارچهای مضر می‌شود.

ب ـ مایه‌زنی کمپوست:
مخلوط کردن اسپاون در یک بستر کشت کاملاً آماده را، مایه‌زنی گویند. زمانی که درجه حرارت کمپوست به حدود ۲۵ درجه سانتیگراد رسید، عمل مایه‌زنی با اسپاون تهیه شده، انجام شد. عمل کشت، درون کیسه‌های پلاستیکی سفید انجام شد، طوری که در هر کیسه، حدود ۳ کیلوگرم کمپوست به ارتفاع ۴۰ سانتیمتر، ریخته شد. جهت سهولت در انجام تهویه، سوراخ‌هایی در ته کیسه‌ها،  ایجاد شد و سر کیسه‌های پلاستیکی، برای جلوگیری از هدر رفتن رطوبت، گره زده شد. سپس کیسه‌ها به اتاق پرورش، که قبلاً با محلول فرمالین گندزدایی شده بود، منتقل شد. رطوبت اتاق در حدود ۹۰ درصد و دمای آن، حدود   درجه سانتیگراد نگه داشته شد. 

ج ـ خاک‌دهی بستر کشت:
پس از ۱۴ روز، میسلیوم‌های قارچ رشد کرده و شروع به پر کردن بستر کشت نمودند
(پنجه دوانی) زمانی که حدود ۷۰ درصد بستر کشت، از میسلیوم‌های قارچ پوشیده شد، سطح بستر کشت را با نوعی خاک باغی، پوشش دادیم. خاک پوششی از جنس خاک باغبانی بود، که با نسبت ۲: ۱ با خاک برگ، مخلوط شده بود. این خاک، ساختمان متخلخل و سبک دارد و ظرفیت نگه‌داری آب بالایی دارد. خاک پوششی قبل از استفاده در دمای ۶۰ درجه سانتیگراد به مدت ۸ ساعت پاستوریزه شد و به ارتفاع ۳ سانتیمتر روی سطح بستر ریخته شد. به منظور تأمین رطوبت میسلیوم‌ها، نیاز بود که خاک پوششی کاملاً آبیاری شود. آبیاری به نحوی انجام گرفت که خاک از آب اشباع شود. از اهداف مهم بکارگیری خاک پوششی، می‌توان به این نکته اشاره داشت که، میسلیوم‌های قارچ A.bisporus زمانی اندم باردهی تولید می‌کنند که با یک محیط فاقد مواد غذایی، برخورد کند. یعنی نوعی استرس و تنش غذایی را متحمل شوند و  همچنین میکروارگانیسم‌هایی در خاک پوششی وجود دارند (Pseudomonas Putida) که باعث فعال شدن ژنهای عامل تولید اندامهای زایشی می‌شوند
(میلر و همکاران، ۱۹۹۵).

هوادهی و افت سریع دما:
پس از رشد میسلیوم‌ها در سطح خاک پوششی، با تهویه هوا و کاهش سریع دما، درجه حرارت را به ۱۵ درجه سانتیگراد رساندیم. این کاهش دما از عوامل محرک محیطی در تشکیل اندام باردهی است. هوادهی برای کاهش دما و کاهش سطح Co2 تجمع یافته در بستر، ضروری است. نور برای تشکیل اندام باردهی در قارچ A.bisporus ضروری نیست. رطوبت هوا،  در حدود ۷۰ درصد نگه داشته شد.
پس از مشاهده اجسام تکمه‌ای، از میزان آبدهی خاک پوششی کاسته شد. مدتی پس از آغاز میوه‌دهی، مقدار Co2 محیط افزایش می‌یابد. این Co2 باعث تداوم رشد رویشی میسلیوم‌ها می‌شود و از تبدیل فاز رویشی به زایشی جلوگیری می‌کند. بنابراین به منظور تداوم میوه‌دهی، مجدداً هوادهی انجام شد. برداشت قارچ با دست انجام گرفت و زمان برداشت، قبل از پاره شدن غشاء زیر کلاهک بود.

 
از شاخص‌هایی که در مدت زمان کشت هموکاریونها و هیبریدها مورد بررسی قرار گرفت، قطر پرگنه در ده والد هموکاریون و همه دور‌گ‌ها بود. قطر پرگنه در محیط کشت، رابطه مستقیمی و مثبت با عملکرد قارچ دارد.
از دیگر شاخصه‌هایی مورد بررسی، تیپ رشدی پرگنه در هموکاریون‌ها بود. تیپ رشدی شامل میسلیوم‌ رشته‌ای، میسلیوم پنبه‌ای، میسلیوم نمدی و… است. بررسی سرعت رشد، مدت زمان تهیه اسپاون و کمپوست از دیگر شاخصه‌های مورد ارزیابی در مدت انجام تحقیق بود.
برای بررسی قابلیت ترکیب‌پذیری عمومی و خصوصی از تجزیه دای‌آلل،  (توسط نرم‌افزار مربوطه) استفاده شد. برای تعیین ضریب همبستگی بین قطر پرگنه و عملکرد نیز از نرم‌افزار Jump استفاده شد. داده‌های بدست آمده مربوط به هر صفت، براساس طرح‌ آماری بلوک‌های کامل تصادفی مورد تجزیه واریانس قرار گرفت. بعد از انجام تجزیه واریانس مقدماتی برای هر صفت، در صورت معنی‌دار شدن اختلافات ژنوتیپی، تجزیه واریانس ترکیب‌پذیری خصوصی و عمومی براساس روش گریفینگ و نرم‌افزار دای الل انجام شد و مقادیر قابلیت ترکیب‌پذیری عمومی و خصوصی با توجه به مدل ریاضی زیر محاسبه شد (گریفینگ، ۱۹۵۶) .
X(ij)= m+g(i)+g(j)+s(i,j)+b(k)+e(i,j)
X(ij): میانگین ژنوتیپ ij ام
m: میانگین جمعیت
g(i): اثر قابلیت ترکیب‌پذیری عمومی برای اولین والد
g(j): اثر قابلیت ترکیب‌پذیری عمومی برای دومین والد
s(i,j): اثر قابلیت ترکیب‌پذیری خصوصی
b(k): اثر بلوک
e(i,j): خطا
همچنین با تعیین نسبت GCA/SCA برای صفاتی که هر دو جزء آنها معنی‌دار شده بود و با استفاده از آزمون آماری F ، اهمیت نسبی هر کدام از اثرات در کنترل صفات، مورد بررسی قرار گرفت.

محاسبه قابلیت ترکیب‌پذیری عمومی و خصوصی:
بنا به تعریف ترکیب‌پذیری عمومی (GCA)   و خصوصی (SCA)   به ترتیب عبارتند از: وضعیت متوسط یک لاین در ترکیب هیبریدی آن و وضعیت دو لاین بخصوص در یک تلاقی بخصوص.
 
 

محاسبه واریانس ترکیب‌پذیری عمومی و خصوصی:
Var(g) =1/n-2(Mg-Ms)
Var(s)=Ms-Me
محاسبه واریانس افزایشی و غالبیت:
گریفینگ نشان داده است که واریانس ژنتیکی در بین هیبریدهای حاصل از تلاقی دای الل برابر است با:
Var(g) =2Var(g)+Var(s)
وی ثابت کرد که در رابطه فوق Var(s) و ۲Var(g) به ترتیب برابر با واریانس غالبیت و واریانس افزایشی هستند. این روابط به صورت زیر نمایش داده می‌شود:
۲Var(g) =Var(A)
Var(s) =Var(D)