جستجو در تک بوک با گوگل!

تابعيت پايگاه تك بوك از قوانين جمهوري اسلامي ايران

نور مرئی و فلورسانس

1,302

بازدید

نور مرئی و فلورسانس ۴٫۰۸/۵ (۸۱٫۵۴%) ۱۳ امتیازs
   جذب و بازتابش متعاقب نور توسط نمونه های ارگانیک و غیر ارگانیک اساسا ناشی از پدیده های فیزیکی همچون فلورسانس و فسفرسانس است. گسیل نور طی فرایند فلورسانس به جهت تاخیر نسبتا کوتاه مدت بین جذب و گسیل فوتون که معمولا کمتر از یک میکروثانیه است، تقریبا همزمان با جذب نور تحریک صورت می گیرد….

جذب و بازتابش متعاقب نور توسط نمونه های ارگانیک و غیر ارگانیک اساسا ناشی از پدیده های فیزیکی همچون فلورسانس و فسفرسانس است. گسیل نور طی فرایند فلورسانس به جهت تاخیر نسبتا کوتاه مدت بین جذب و گسیل فوتون که معمولا کمتر از یک میکروثانیه است، تقریبا همزمان با جذب نور تحریک صورت می گیرد.
دانشمند انگلیسی سر جورج جی. استاکس برای نخستین بار در سال ۱۸۵۲ با مشاهده گسیل نور قرمز از فلوریت بر اثر تحریک توسط نور ماوراء بنفش این واژه را تعریف کرد. استاکس چنین بیان کرد که گسیل فلورسانس همواره در طول موج بلندتری نسبت به نور برانگیختگی اتفاق می افتد. تحقیقات و بررسیهای اولیه در قرن نوزدهم نشان دادند که بسیاری از نمونه ها( شامل کانیها، کریستالها، رزینها، روغن، کلروفیل، ویتامینها و ترکیبات غیر آلی) زمانی نور فلورسانس از خود گسیل می کنند که در معرض تابش نور ماوراء بنفش قرار بگیرد. هرچند، از دهه ۱۹۳۰ به بعد بود که کاربرد فلوروکرومها در تحقییقات بیولوژیکی به منظور نشان دار کردن بافتها، باکتری و سایر پاتوژنها رواج یافت. برخی از انواع این نشانها بسیار خاص بوده و همزمان با پیشرفت میکروسکوپ فلورسانس گسترش یافتند.
تکنیک میکروسکوپ فلورسانس از مهمترین ابزارهای کاربردی در علوم بیولوژیکی و بیوپزشکی و نیز علوم مواد به شمار می آید چراکه این میکروسکوپها مزایایی را دارند که در سایر شیوه های کنتراست با استفاده از میکروسکوپهای سنتی نوری دیده نمی شود. کاربرد یک آرایه از فلورسانسها امکان شناسایی سلولها و بافتهای سلولی فوق العاده کوچک را با ویژگیهای بسیار خاص در میان ترکیبات غیر فلورسانسی میسر می سازد. در واقع، میکروسکوپ فلورسانس قابلیت آشکارسازی تک مولکولها را دارد. البته با استفاده از برچسب فلورسانس چندگانه ، ردیابهای مختلف قادر اند به طور همزمان چندین مولکول هدف را شناسایی کنند. هرچندمیکروسکوپ فلورسانس نمی تواند تفکیک پذیری فضایی را در کمتر از حد پراش نمونه ها فراهم کند ، با این وجود آشکارسازی مولکولهای فلورسانس در پایینتر از چنین حدی به سهولت امکان پذیر است.
پدیده خود فلورسانس در بسیاری از نمونه های متنوع، زمانی که در معرض تابش قرار می گیرند ،دیده می شود. پدیده ای که به طور گسترده در زمینه های مختلفی همچون گیاه شناسی، سنگ شناسی و صنایع مربوط به نیمه رساناهابه کاربرده می شود. در مقابل، مطالعه بافتهای حیوانی و پاتوژنها غالبا با نور های فوق العاده کم و روشن و نیز خود فلورسانس نامعین بسیار دشوار است.هرچند در مطالعات اخیر از فلورو کرومها ( که به آن فلوروفور نیز گفته می شود) نیز استفاده می شود که توسط طول موجهای خاصی از نور تابشی تحریک شده و نور های با شدت معین ساتع می کنند. فلوروکرومها که به طیفهای مرئی و مادون مرئی متصل می شود ، غالبا بازده کوانتومی بالایی دارند( نسبت جذب فوتون به گسیل) . کاربرد میکروسکوپ فلورسانس همگام با پیشرفتهای بیولوژیکی ،به دلیل ایجاد فلوروفورهای ترکیبی جدید با شدتهای برانگیختگی و گسیل مشخص که به حالت طبیعی بوجود می آیند، رشد گسترده ای پیدا کرده است.

اصول برانگیختگی و گسیل
از عملکردهای اصلی یک میکروسکوپ فلورسانس، روشن سازی نمونه ها با باند طول موجی خاص و مطلوب ودر مرحله بعد جداسازی فلورسانس گسیلیده بسیار ضعیف از نور تحریک است. در یک میکروسکوپ با ساختار مناسب ، تنها نور گسیلی است که می بایست به چشم و یا آشکارساز برسد. در ضمن معمولا تاریکی پس زمینه حدود آشکار سازی را کنترل می کند، و نور تحریک عموما چند صد هزار تا یک میلیون بار از نور فلورسانس گسیلیده روشنتر است.
در شکل ۱ نمای نیم رخی از یک سیستم اپی فلورسانس مدرن در میکروسکوپ فلورسانس عبوری و انعکاسی نشان داده شده است. در یک انتهای سیستم روشنایی عمودی در قسمت مرکزی دستگاه ،منبع نوری و در انتهای دیگربرجک مکعبی فیلتر قرار گرفته است. این دستگاه از یک میکروسکوپ نوری انعکاسی پایه تشکیل شده که در ان طول موج نور بازتابی طولانی تر از نور تحریک است. ایجاد سیستمهای روشنایی فلورسانس درمیکروسکوپ فلورسانس نور بازتابی به نام Johan S. Ploemثبت شده است. در سیستم روشنایی عمودی فلورسانس ، نور با طول موج خاص ( ویا باند طول موجی مشخص) غالبا در طیف ماوراء بنفش و یا ناحیه آبی یا سبز طیف مرئی ، با عبور نور چند طیفی از لامپ و یا سایر منابع از یک فیلتر تحریک با طول موج انتخابی ایجاد می گردد. طول موجهایی که از فیلتر تحریک عبور می کنند ، از سطح یک آینه دو رنگ نما (که دیکروییک نیز نامیده می شود) و یا شکافنده پرتو منعکس می شونند. چنانچه نمونه ها فلوئورسان باشند و از خو نور ساتع کنند، این نور توسط عدسی جمع شده و با بازتابش از سطح آینه دو رنگ نما به سطح فیلتر مانع( گسیل) برخورد کرده و فیلتر می شود. این فیلتر در واقع مانع از عبور طول موجهای تحریک ناخواسته می گردد. لازم به ذکر است که فلورسانس تنها شیوه در میکروسکوپ نوری است که طی آن نمونه ها، پس از تحریک ، از خود نور ساتع می کنند. نور ساتع شده مجددا در تمامی جهات بدون توجه به جهت منبع نور تحریک تابیده می شود.
میکروسکوپ اپی-فلورسانس از جمله پر قدرتترین تکنیکهای میکرسکوپی نوین به شمار می آید. دراین میکروسکوپ سیستم روشنایی عمودی انعکاسی بین تیوبهای دید و محفظه رو دماغی (nosepiece)عدسی شیئی قرار گرفته است. نور تحریک ابتدا از عدسی شیئی میکروسکوپ گذشته ( که در اینجا به عنوان یک کندانسور(عدسی محدب) عمل می کند) و به نمونه می تابد، در نهایت نور فلورسانس گسیل شده با استفاده از همان عدسی دریافت می شود. این نوع سیستم روشنایی دارای مزایای بسیاری است از جمله آنکه عدسی شیئی میکروسکوپ در ابتدا به عنوان یک کندانسور(عدسی محدب) و در مرحله بعد به عنوان یک جمع کننده نور ایجاد کننده تصویر عمل می کند. از سوی دیگر، به عنوان یک سیستم واحد، عدسی شیئی/کندانسور همواره انطباق کاملی دارند. قسمت اعظم نور تحریکی که به نمونه می رسد بدون رخداد هیچ گونه بر همکنشی از نمونه ها گذشته و از عدسی دور می شود ، و سپس ناحیه روشن شده توسط عدسی چشمی دیده می شود( دراغلب موارد) . در نهایت، این روش امکان ترکیب و یا تناوب سازی بین مشاهده نور فلورانس انعکاسی و نیزدریافت تصاویر دیجیتالی را میسر می سازد.
 
سیستم روشنایی عمودی نور انعکاسی از یک محفظه لامپ arc-discharge در قسمت عقب ( که معمولا جیوه ای و یا زنونی است) تشکیل شده است. نور تحریک باگسیلش در راستای سیستم روشنایی عمود بر محور نوری میکروسکوپ از لنزهای جمع کننده و یک دریچه دیافراگم با قابلیت تنظیم و در نهایت یک دیافراگم زمینه (به شکل ۱ رجوع کنید) عبور می کند. این نور سپس به فیلتر تحریک رسیده و در آنجا باند طول موجی مطلوب انتخاب و از عبور طول موجهای ناخواسته جلوگیری میشود. طول موجهای انتخاب شده ،پس از عبور از فیلتر تحریک، به آینه شکافنده اشعه دورنگ نما رسیده که به عنوان یک صافی تداخل ،طول موجهای کوتاه را بازتاب و طول موجهای بلند را عبور می دهد. این آینه شکافنده اشعه دو رنگ نما نسبت به نور تحریک ورودی با زاویه ۴۵ درجه قرار گرفته و نور را بازاویه ۹۰ درجه مستقیما به سمت عدسی شیئی و درنهایت نمونه منعکس می سازد. گسیل نور فلورسانس که توسط نمونه در معرض نور قرار گرفته ایجاد می شود ،بوسیله عدسی شیئی جمع شده و در نهایت توسط عدسی چشمی تصویر ایجاد شده دیده می شود. از آنجا که نور گسیل شده در مقایسه با نور تحریک طول موج بلندتری دارد ،این نور قادر است تا از آینه دورنگ نما و تیوبهای مشاهده و یا آشکارساز الکترونیکی عبور نماید.
اکثر نور تحریک متفرق شده که به آینه دو رنگ نما می رسد، به عقب به سمت منبع نور بازتابیده می شود، هرچند که مقدار ناچیزی ازآن غالبا عبورو توسط پوشش داخلی آینه جذب می گردد. پیش از انکه نور فلورسانس عبوری به عدسی شیئی و یا آشکار ساز برسد، ابتدا می بایست از فیلتر مانع عبور نماید. این فیلتر از عبور نور تحریک باقی مانده جلوگیری کرده و نورهای گسیلی با طول موج بلندتر را عبور می دهد. در اغلب سسیستمهای نور انعکاسی، همانطور که در شکل ۲ نشان داده شده است،فیلتر تحریک ،آینه دورنگ نما و نیز فیلتر مانع روی هم یک بلوک نوری را تشکیل می دهد( که غالبا مکعبی شکل است) میکروسکوپهای نوری نوین قادربه جا سازی ۴ تا ۶ مکعب فلورسانس (معمولا بر روی یک رولور گردان و از طریق یک مکانیسم لغزنده؛ شکل ۱) اند و این ویژگی امکان جایگذاری سریع فیلترهای تحریک و مانع و نیز آینه های دورنگ نما را فراهم می سازد.
طراحی سیستم روشنایی عمودی می بایست به گونه ای باشد که امکان تنظیم میکروسکوپ برای روشنایی کهلر را میسر ساخته ویک دریچه روشنایی رادر میدان دید ایجاد نماید. از سوی دیگر، لنزهای چگالنده اصلاح شده در سیستم نوری می بایست به گونه ای باشد که مشخص کند تصویر دریچه دیافراگم با روزنه عقب عدسی شیئی فوکوس توام است. در منابع نورمربوط به میکروسکوپهای نوین ، تصویر دریچه زمینه از پیش تنظیم شده با نمونه فوکوس شده ونیز سطح دیافراگم عدسی چشمی ثابت توام است.
محفظه لامپ منبع نور معمولا ازیک فیلتر مانع نور مادون قرمز تشکیل شده است. محفظه لامپ می بایست به گونه ای باشد که طول موجهای ماوراءبنفش را که بسیار مضر هستند از خود ساتع نکند و مجهز به سوییچی باشد که اگر محفظه طی عملیات به طوراشتباه باز شد ، لامپ به طور اتوماتیک خاموش شود. استحکام این محفظه ها می بایست در حدی باشد که مقاومت کافی را در برابر انفجارهای احتمالی ( لامپ arc-discharge) داشته باشد. در محفظه های لامپ جدید ، سوکت لامپ مجهز به دکمه های قابل تنظیمی است که امکان تمرکز تصویر لامپ قوسی را در روزنه عقبی عدسی شیئی ( در سیستم روشنایی کوهلر، این صفحات توام هستند) فراهم می سازد. در نقاطی از مسیر نور، معمولا نزدیک به محفظه لامپ و در قسمت جلویی فیلتر تحریک ، برای ممانعت کامل از عبور نور تحریک زمانی که نمونه توسط آشکارساز دیده نمی شود و تصویری از ان نیز به دست نمی آید ،وجود یک شاتر می تواند مفید وکمک کننده باشد. علاوه براین برای انکه کاربر بتواند شدت نور تحریک را کاهش دهد ، می بایست تدارکاتی برای فیلترهای چگالی خنثی ( بر روی یک چرخ،رولور و یا لغزنده) در نظر گرفته شود.
جابجایی استوک
انرژی ارتعاشی زمانی تلف می شود که الکترنها از حالت برانگیخته به حالت عادی باز می گردد. در نتیجه اتلاف انرژی ، طیف گسیلی یک فلوروفور برانگیخته معمولا در مقایسه با طیف جذب یا تحریک به طول موجهای بلندتر تغییر می یابد (توجه داشته باشید که طول موج به طور معکوس به انرژی تابشی تغییر می یابد) که این پدیده قانون استوک یا جابجایی استوک نامیده می شود. با افزایش مقدار جابجایی استوک ، با استفاده از ترکیبات فیلتر فلورسانس ، جداسازی نور تحریک از نور گسیلی تسهیل می گردد.
پیک شدت نور گسیلی (یا جذب ) فلوروفور معمولا کمتر از طول موج و بزرگی پیک تحریک است و منحنی طیفی نور گسیلی غالبا تصویر اینه ای(یا نزدیک به آن) است ازمنحنی تحریک، با این تفاوت که طول موجهای آن بلندتراست. همانطور که در شکل ۳ برای Alexa Fluor 555 آمده است، این سیستم یک ردیاب مفید است که نور را در ناحیه زرد-سبز جذب نموده و نورهای گسیلی به رنگ زرد-نارنجی را ایجاد می کند. برای افزایش شدت نور فلورسانس به حداکثر میزان، یک فلوفور( که معمولا رنگ نامیده می شود)معمولا در طول موجهایی نزدیک به پیک منحنی تحریک برانگیخته و وسیعترین محدوده ممکن از طول موجهای گسیلی را که شامل پیک گسیل می گردد ،ایجاد می کند. انتخاب طول موجهای تحریک و گسیلی معمولا براساس فیلترهای تداخل صورت می گیرد(شکل ۲).گذشته ازاین، واکنش طیفی یک سیستم نوری میکروسکوپی معمولا به فاکتورهایی همچون بازدهی انتقالی شیشه ای( به دلیل وجود پوششهای ضد انعکاس) ، تعداد لنزها و اجزای آینه ای و نیز سرعت عکس العمل سیستم اشکارساز بستگی دارد.
جداسازی و آشکارسازی موثر طول موجهای تحریک و گسیلی در میکروسکوپهای فلورسانس با انتخاب مناسب فیلترهایی که برای عبور و یا ممانعت از عبورباندهای طول موجی خاص در طیف ماوراء بنفش،مرئی،و زیر قرمز نزدیک مورد استفاده قرار می گیرد، انجام می شود. منابع نور عمودی فلورسانس با هدف کنترل نور تحریک با جوف گذاری فیلترهای با قابلیت تعویض آسان ( متعادل کننده های چگالی خنثی و نیز تحریک تداخل ) در مسیر نور به سمت نمونه و مجددا در مسیر بین نمونه و تیوبهای مشاهده و یا سیستمهای آشکارساز دوربینی طراحی شده است. شاید مهمترین فاکتور در نورهای گسیلی فلورسانس با شدت نسبتا پایین ان است که منبع نوری که برای تحریک مورد استفاده قرار می گیرد،از روشنایی کافی برخوردار باشد تا بدین ترتیب شدت نور گسیلی به حد ماکزیمم رسیده و فلوروکرومها از خواص جذبی و بازده ای کوانتومی گسیلی کافی برخوردار باشد.
راندمان جذب یک فوتون توسط یک فلوروفور خاص به مقطع عرضی مولکولی بستگی دارد و میزان احتمال جذب آن ضریب جذب نامیده می شود. هرقدرکه ضریبهای جذب بیشتر باشد، احتمال جذب یک فوتون (کوانتوم)در ناحیه طول موجی مشخص بیشتر خواهد بود. بازدهی کوانتومی در واقع نسبت تعداد کوانتومهای گسیل شده را به کوانتومهای جذب شده ( معمولا بین ۰٫۱ تا ۱٫۰) نشان می دهد. بازدهی کوانتومی کمتر از ۱ ناشی از اتلاف انرژی در مسیرهای غیر تابشی نظیر واکنشهای فوتوشیمیایی و یا حرارتی است. ضریب جذب و بازدهی کوانتومی که در واقع نشان دهنده شدت روشنایی منبع نور است و نیز دوام فلورسانس همگی از فاکتورهای مهمی هستند که بر شدت و استفاده از گسیل نور فلورسانس تاثیر می گذارد.
محوسازی، فرونشانی و سفید سازی تصویر
شرایط طیفی گسترده ای بر گسیل فلورسانس بازتابش تاثیر می گذارد واز شدت آن می کاهد. محوسازی واژه ایست که برای کاهش شدت گسیل فلورسانس مورد استفاده قرار می گیرد. سفیدسازی تصویر در واقع تجزیه غیر قابل تغییر مولکولهای فلورسانت در حالت برانگیختگی آنهم به جهت برهمکنش با اکسیژن مولکولی پیش از گسیل می باشد. بازیافت فلورسانس پس از سفیدکاری تصویر (FRAP) ،از مکانیسمهای بسیار مفید برای بررسی تفرق و حرکت ماکرومولکولهای بیولوژیکی به شمار می اید. در این شیوه ،ناحیه مشخصی از نمونه در معرض نور لیزری قرارمی گیرد. تکنیک کنترل اتلاف فلورسانس در سفید سازی تصویر(FLIP)برای تعیین میزان کاهش نور فلورسانس در یک ناحیه مشخص نزدیک به ناحیه سفید سازی شده به کاربرده می شود. مشابه با FRAP، تکنیک دوم نیز برای تعیین میزان تحرک و پویایی مولکولی در سلولهای زنده مورد استفاده قرار می گیرد.

در شکل ۴ مثال مشخصی از سفید سازی تصویر اورده شده (محوسازی) است ،با ارائه تصاویر دیجیتالی که در زمانهای مختلف از سلولهای فیبروبلاست اپیدرمیس آهوی Indian Muntjac تهیه شده است. هسته ها توسط bis-benzimidazole (Hoechst 33258؛ فلورسانس آبی رنگ  میتوکندریها و آکتین کیتواسکلتون توسط یک MitoTracker Red CMXRos فلورسانس قرمز) وفالوئیدین توسط Alexa Fluor 488 فلورسانس سبز به ترتیب بی رنگ می شوند. در این روش،وقفه های زمانی دو دقیقه ای با استفاده از یک فیلتر فلورسانس با پهناهای باند متفاوت به گونه ای در نظر گرفته شده اند که سه فلوروفور به طور همزمان تحریک و سیگنالهای گسیلی را ثبت شونند. توجه داشته باشید که سه فلوروفور در شکل (a)4، شدت نسبتا بالایی دارند، اما شدت فلوروفور Hoechstآبی ظرف مدت دو دقیقه به شدت کاهش یافته به گونه ای که ظرف ۶ تا ۸ دقیقه به طور کامل از بین می رود. میتوکندری و اکتینها در برابر سفیدسازی تصویر بسیار مقاوم اند،اما شدت آن به میزان زیادی درتوالیهای دوره ای کاهش می یابد(۱۰ دقیقه ای). فرونشانی حالت برانگیختگی منجر به کاهش شدت نور فلورسانس طی مکانیسمهای مختلفی همچون اتلاف انرژی غیر رادیواکتیو می گردد و غالبا بر اثر فاکتورهای اکسیداسیون مختلف و در حضور نمکها ،فلزات سنگین و یا ترکیبات هالوژنی رخ می دهد. در برخی موارد ، این فرونشانی ناشی از انتقال انرژی به سایر مولکولهایی( که پذیرنده نامیده می شود) است که از نظر موقعیتی به فلوروفور برانگیخته( دهنده) نزدیک هستند . این پدیده به عنوان انتقال انرژی رزونانس فلورسانس (FRET)نامیده می شود که عنوان مبنای تکنیکهای مختلفی به شمار می آید که به مطالعه بر همکنش های مولکولی با تفکیک پذیری افقی بسیار پایین می پردازد.

منابع نور فلورسانس
یکی از پیامدهای منفی سطوح گسیل پایین ،تعداد بسیار کم فوتونهایی است که به چشم و یا آشکارساز دوربین می رسد. در اغلب موارد ، بازدهی تمرکزمیکروسکوپهای نوری کمتر از ۳۰ درصد و تمرکز بسیاری از فلوروفورها در مسیر نوری در حد میکرومولار و نانومولار است. به منظور ایجاد شدت نور تحریک کافی با گسیلش قابل شناسایی،منابع نور کوچک و در عین حال قوی مانند لامپهای پرانرژی arc-discharge مورد نیاز است. متداولترین نوع این لامپهاعبارت اند از:لامپهای جیوه ای با ولتاژبین ۵۰ تا ۲۰۰ وات و لامپهای زنونی بین ۷۵ تا ۱۵۰ وات ( شکل ۵). این منابع نور معمولا توسط یک منبع جریان مستقیم بیرونی تغذیه می شود که قدرت کافی را برای روشن سازی در حین یونیزاسیون بخار و نیز تداوم بدون کمترین میزان لرزش را دارا هستند.

منبع تغذیه بیرونی لامپ arc-discharge میکروسکوپ معمولامجهز به تایمری است که تعداد ساعات کار کرده را نشان می دهد. بازدهی این لامپها ،در صورتی که بیش از طول عمر ارزیابی شده (۲۰۰ تا ۳۰۰ ساعت) مورد استفاده قرار گیرند، کاهش یافته و حتی احتمال ترکیدن آنها نیز می رود. شدت لامپهای جیوه ای در رینج طیفی بین ماوراء بنفش تا مادون قرمزناچیز است و بیشترین میزان شدت ان مربوط به طیف نزدیک به ماوراء بنفش است به گونه ای که حداکثر پیکهای شدت در حدودهای ۳۱۳،۳۳۴،۳۶۵، ۴۰۶، ۴۳۵، ۵۴۶ و ۵۷۸ نانومتردیده می شود. در طول موجهای دیگرمربوط به ناحیه نور مرئی، میزان شدت نور ثابت اما چندان روشن نیست( اما در موارد بسیاری کاربرد دارد). در بازدهی روشنایی، تنها توان لامپ به عنوان یک فاکتور تعیین کننده به شمار نمی آید، بلکه روشنایی متوسط به عنوان یکی از اصلیترین پارامترها در کنار پارامترهای دیگری همچون روشنایی منبع و نیز سرعت زاویه ای گسیل محسوب می گردد.

طی دو سال گذشته، استفاده از منابع نور لیزری خصوصا لیزرهای آرگون-یون و آرگون-کریپتون(یون) در میکروسکوپی نوری کاربرد چشمگیر و گسترده ای پیدا کرده است. از جمله ویژگیهای این لیزرها می توان به منابع نور کوچک، میزان واگرایی کم، تقریبا تک کرومیوم و نیز روشنایی متوسط بالا را نام برد. کاربرد این منابع نوری خصوصا اهمیت بسیاری در میکروسکوپی همکانون پویشی پیدا کرده و به عنوان یک ابزار قدرتمند در پرداخت تصاویر فلورسانس با وضوح بالا مطرح شده و این امربا رد نور غیر فوکوس که ازصفحه کانونی نمونه دور می شود ،انجام می گیرد. میکروسکوپهای همکانون این کار را با پویش نقطه ای ویا خطی همزمان با تصویربرداری و از طریق یک دریچه مزدوج انجام می دهد. بخشهای نوری نمونه ها را می توان در یک کامپیوتر میزبان ذخیره وبه این ترتیب تصویر نهایی را از نو ایجاد و در نهایت بر روی مانیتور نشان داد.
اصطلاحات فنی متداولی که دررابطه با فیلترهای میکروسکوپ فلورسانس به کاربرده می شود به دلیل دارابودن کدهها و حروف ابتدایی متفاوتی که در مورد هر اصطلاح توسط تولید کنندگان مختلف به کاربرده می شود ،بسیار گیج کننده هستند. اساسا فیلترها به سه دسته تقسیم می شونند: تحریک( غالبا به عنوان تحریک کننده ها مطرح می شونند)، مانع(گسیل) و فیلترهای شکافنده اشعه دو رنگ نما( آینه های دو رنگ نما). فیلترهای فلورسانس پیشتر از گاز رنگ شده ویا ژلاتینی که بین دو صفحه شیشه ای قرار می گرفت، ساخته می شد. اما در حال حاضر تمایل سازندگان بیشتر به سمت تولید فیلترهای با تفکیک بالا به همراه اپتیکهای تداخلی فیلترهای تحریک بیشتر شده است که این فیلترها موجب عبور و یا انعکاس نور با طول موجهای خاصمی شوند،البته زمانی که در مسیر نور با زاویه ۴۵ درجه قرار گیرد (مراجعه به شکل ۱ و ۲). فیلترهای مانع از شیشه رنگی و یا روکشهای تداخل (یا ترکیبی از هردو ) ساخته شده است.
اختصاراتی که توسط تولیدکنندگان برای شناسایی خواص فیلترهای تحریک به کاربرده می شود عبارت اند از: UG (شیشه ماوراء بنفش) و BG (شیشه آبی). فیلترهای Shortpass غالبا به صورت KP ( K مخفف کلمه kurz،به معنای “کوتاه” در زمان آلمانی است) و یا به سهولت به صورت SP مشخص می شود. برخی تولیدکنندگان، فیلترهای تداخل را با علامت اختصاری IF نشان می دهند. البته استفاده فیلترهای تداخل تحریک باند کوتاه ،خصوصا چنانچه جابجایی استوک کم باشد ،بسیار مفید و کارامد خواهند بود.
سرنامها یا اختصاراتی که در فیلترهای مانع مورد استفاده قرار می گیرد عبارت اند از: LP یا L در فیلترهای با باند بلند ، Y یا GG درشیشه های زرد یا gelb(آلمان) ، Rیا RG در شیشه قرمز،OG یا O در شیشه نارنجی، K (نوعی واژه المانی مخفف کلمه kante )در فیلترلبه ای و BA در مورد فیلترهای مانع به کار برده می شود.
اصطلاحات فنی متداولی که دررابطه با فیلترهای میکروسکوپ فلورسانس به کاربرده می شود به دلیل دارابودن کدهها و حروف ابتدایی متفاوتی که در مورد هر اصطلاح توسط تولید کنندگان مختلف به کاربرده می شود ،بسیار گیج کننده هستند. اساسا فیلترها به سه دسته تقسیم می شونند: تحریک( غالبا به عنوان تحریک کننده ها مطرح می شونند)، مانع(گسیل) و فیلترهای شکافنده اشعه دو رنگ نما( آینه های دو رنگ نما). فیلترهای فلورسانس پیشتر از گاز رنگ شده ویا ژلاتینی که بین دو صفحه شیشه ای قرار می گرفت، ساخته می شد. اما در حال حاضر تمایل سازندگان بیشتر به سمت تولید فیلترهای با تفکیک بالا به همراه اپتیکهای تداخلی فیلترهای تحریک بیشتر شده است که این فیلترها موجب عبور و یا انعکاس نور با طول موجهای خاصمی شوند،البته زمانی که در مسیر نور با زاویه ۴۵ درجه قرار گیرد (مراجعه به شکل ۱ و ۲). فیلترهای مانع از شیشه رنگی و یا روکشهای تداخل (یا ترکیبی از هردو ) ساخته شده است.
اختصاراتی که توسط تولیدکنندگان برای شناسایی خواص فیلترهای تحریک به کاربرده می شود عبارت اند از: UG (شیشه ماوراء بنفش) و BG (شیشه آبی). فیلترهای Shortpass غالبا به صورت KP ( K مخفف کلمه kurz،به معنای “کوتاه” در زمان آلمانی است) و یا به سهولت به صورت SP مشخص می شود. برخی تولیدکنندگان، فیلترهای تداخل را با علامت اختصاری IF نشان می دهند. البته استفاده فیلترهای تداخل تحریک باند کوتاه ،خصوصا چنانچه جابجایی استوک کم باشد ،بسیار مفید و کارامد خواهند بود.
سرنامها یا اختصاراتی که در فیلترهای مانع مورد استفاده قرار می گیرد عبارت اند از: LP یا L در فیلترهای با باند بلند ، Y یا GG درشیشه های زرد یا gelb(آلمان) ، Rیا RG در شیشه قرمز،OG یا O در شیشه نارنجی، K (نوعی واژه المانی مخفف کلمه kante )در فیلترلبه ای و BA در مورد فیلترهای مانع .

فیلترهای شکافنده اشعه دورنگ نما نیز با مخففهای مختلفی نشان داده می شوند نظیر CBSبرای یک شکافنده اشعه دورنگ نما ، DM برای آینه دورنگ نما، TK برای “teiler kante”، واژه آلمانی که به معنای صافی چاکدا ر است، FT برای “farb teiler” (واژه آلمانی که به معنای شکافنده رنگ است)و RKP برای باند کوتاه انعکاس. تمامی این واژه ها می بایست قابل تغییر باشد ، در حال حاضر شکافنده های اشعه دورنگ نمای جدید با پوششهای تداخل بر روی شیشه نوری ساخته می شود( در مقابل رنگهای متالیک یا ارگانیک). البته فیلمهای کوچک تداخل برای ایجاد بازتاب پذیری بالا در طول موجهای کوتاه ونیز انتقال با سرعت بالا در طول موجهای بلندتر طراحی شده اند. شکافنده های طول موج دورنگ( نما) با وضعیت قرار گیری در حالت زاویه ۴۵ درجه در مسیر نور تحریک ، مانعهای نوری را مسیر نور فلورسانس بازتاب شده ایجاد می کند که عملکرد اصلی آنها تغییر جهت طول موجهای (کوتاه تر) تحریک انتخاب شده به سمت عدسی شیئی و در نهایت نمونه است. از دیگر ویژگیهای این فیلترها می توان عبورنور فلورسانس با طول موج بلندتر و بازتاب نورهای تحریک تفرق یافته به عقب و به سمت محفظه لامپ را نام برد .
 
درنمودار شکل ۶ ، منحنیهای انتقال در یک فیلتر فلورسانس خاص در سیستمهای میکروسکوپی جدید نشان داده شده است. طیف امواج فیلترتحریک (منحنی قرمز) سطح انتقال بالایی را (تقریبا ۷۵ درصد) در حدود بین ۴۵۰ تا ۴۹۰ نانومتر با طول موج مرکزی (CWL) 470 نانومترایجاد می کند. اینه دورنگ (منحنی زرد) طول موجهای ناحیه طیف تحریک را منعکس می سازد ،حال انکه طول موجهای بلندتر و کوتاهتر با راندمان نسبتا بالاتری منعکس می گردد. توجه داشته باشید که انتقال صفر درصدی درمنحنی اینه دورنگ نما مطابق با انعکاس ۱۰۰ درصدی است. شیب قابل توجه در منحنی انتقال بین حدود ۴۵۰ تا ۵۰۰ ، که نشانگریک پیک انعکاسی است، برای انعکاس طول موج باندهایی که از فیلتر تحریک با زاویه ۹۰ درجه عبور وبه نمونه می رسد،به کاربرده می شود. قسمت انتهایی این سیستمها فیلتر مانع یا گسیلی ( منحنی سفید) است که موجب انتقال طول موجها در ناحیه نور مرئی سبز درحدود بین ۵۲۰ تا ۵۶۰ نانومتر می گردد.
محدوده های بین باندهای طول موجی انتقالی و انعکاس به گونه ای است که شیب ان برای جداسازی تقریبا کامل طول موجهای بازتابی و انتقالی کافی است. الگوی تابیدگی بالا و پایین اسپایکها که در طیف امواج اینه دورنگ(نما) دیده می شود از مهمترین تاثیرات این فرایند به شمار می آید. عملکرد این ترکیب فیلتری چشمگیر و نوعی دمونستراسیون اشکارآن ازجمله پیشرفتهای است که در تکنولوژی فیلتر تداخل با استفاده از فیلمهای نازک صورت گرفته است.
فهرست واژه ها و اصطلاحات فیلتر که توسط نیکون به کاربرده شد، ازمجموعه واژگانی مشتق شده که کاربرد آن به اوایل دهه ۱۹۹۰ بازمی گردد. دران زمان، تمامی ترکیبات فیلتری متممی نیکون با کمک تکنیک اسپاتر با پوششهایی از جنس سخت ایجاد شدند ، اما دربسیاری از فیلترهای در دسترس متداول از شیوه های پوششی نرمتراستفاده می شود. از جمله ویژگیهای پوششهای نرم آن است که نسبت به کاهشهای دمایی و رطوبتی حساستر اند ولذا می بایست با در مقایسه با فیلترهای با پوشش سخت با دقت بیشتری از آنها استفاده کرد.اگاهی از فهرست واژه ها و لغات کد فیلتر نیکون مکانیسمی را برای تعیین سریع اینکه آیا مجموعه به قدر کافی برای یک فلورورخاص کاربرد دارد یا خیر،کمک می کند.
نخستین حرف در کد نامگذاری حرفی -عددی اختصاصی در فیلترها ناحیه طیفی تحریک طول موجی( برای مثال UV, V, B و G که به ترتیب اختصارات ساده ای برای طول موج ماوراء بنفش، بنفش، آبی و سبز می باشد)را نشان می دهد. از سوی دیگر، رقمی که پس از کد تحریک قرار می گیرد ،به پهنای نوار گذرفیلتر تحریک بستگی دارد: ۱ برای تحریک باند کوتاه، ۲ برای تحریک باند عرض و متوسط و ۳ برای تحریک باند بسیار عریض. در نهایت، یک یا دو حرفی که پس از رقم مربوط به اندازه نوار گذر تحریک قرار می گیرد ،ویژگیهای فیلترمانع را مشخص می سازد. کد A نشان دهنده یک فیلتر مانع با نوار گذر استاندارد با کمترین طول موج است، حال آنکه کدB طول موج بالاتری را برای یک فیلتر گسیل با نوار گذر طولانی تر نشان می دهد. فیلترهای گسیل نوار گذر با حرف E (به معنای “افزایش یافته”) مشخص می شونند . فیلترهای E/C ،واحدهای تداخل با پوشش نرم است که برای بهبود کارایی در ردیابهایی همچون DAPI, FITC, TRITC و Texas Red.طراحی شده اند.
میکروسکوپ نوری از آنجا که از نورهای مرئی برای شناسایی اجسام کوچک استفاده می کند ، از جمله متداولترین و پرکاربردترین ابزارهای تحقیقاتی در مطالعات بیولوژیکی به شمار می آید. هرچند هنوز هم بسیاری از دانش آموزان و معلمان از مزایای میکروسکوپهای نوری به طور کامل اگاه نیستند. از آنجا که بسته به کیفیت و نیز چند کاربری بودن میکروسکوپ ،قیمت این میکروسکوپها نیزافزایش می یابد، لذا کاربران برنامه های آکادمیک نمی توانند از آنها استفاده کنند. انواع گرانقیمت این میکروسکوپهای نوری تصاویر جالبی را در اختیار دانش اموزان قرار داده و تجارب آنها را نیز افزایش می دهد.
بزرگترین چالشهایی که یک تازه کاردرحین مشاهده اجسام ریز توسط میکروسکوپها با بزرگنمایی مناسب برخورد می کند عبارت اند از:

•دستیابی به کنتراست مطلوب
•یافتن صفحه کانونی
•دستیابی به تفکیک پذیری ایده ال
•تشخیص نمونه زمانی که توسط میکروسکوپ مورد مطالعه قرار می گیرد.

از این میکروسکوپها برای مشاهده اجسام بسیار ریز همچون باکتریها با بزرگنمایی ۱۰۰x استفاده می شود. البته این اجسام توسط میکروسکوپهای زمینه روشن قابل مشاهده نیستند. در ادامه به شرح انواع اپتیکهایی که برای دستیابی به کنتراست مطلوب مورد استفاده قرار می گیرد،همین طورارائه روشهایی برای یافتن و نیز فوکوس بر روی نمونه وارائه روشهایی برای استفاده ازابزارهای اندازه گیری توسط میکروسکوپ نوری پرداخته می شود.

دانلود کتاب






مطالب مشابه با این مطلب

    اسید و خطرات آن

    کلمه «اسید» (به انگلیسی:acid) از واژه لاتین acidus به معنای «ترش مزه» آمده‌است. تعاریف گوناگونی برای اسید و باز وجود دارد، از جمله تعاریف آرنیوس، لوری-برونستد و لوییس. تعریف قدیمی اسیدها موادی ترش مزه اند خاصیت خورندگی دارند شناساگرها را تغییر رنگ می دهند […]

    تکنولوژی شیمیایی

    تکنولوژی شیمیایی ۳٫۵۰/۵ (۷۰٫۰۰%) ۱۰ امتیازs شیمی کاربردی از چندین نسل قبل مواد شیمیایی بوجود آمده اند. این سلاح ها با پیشرفت و تکامل تکنولوژی کامل و پیشرفت کرده و تاکنون توانسته اند جای بسیاری از انسان ها را بگیرند این سلاح ها به […]

    ذخایر معدنی

    ذخایر معدنی ۴٫۵۰/۵ (۹۰٫۰۰%) ۲ امتیازs معدن:معدن محدوده ای است که از آن یک یا چند ماده معدنی استخراج شده یا می گردد. در این بانک اطلاعات مربوط به ۳۱۳۲ معدن کشور ارائه شده است، که هر معدن دارای اطلاعات عمومی نظیر مشخصات معدن، […]

    لوله های فلزی پلیمری
    فلزات سنگین

    فلزات سنگین ۴٫۰۰/۵ (۸۰٫۰۰%) ۸ امتیازs تعداد ۳۲ نمونه غذا ، آب منابع و عضله ماهی به منظور اندازه گیری فلزات سرب و آهن در فصلهای تابستان و پاییز ، در دو نوبت با فاصله ۳ ماه از چهار مزرعه پرورش ماهی قزل آلای […]

    شیمی مدرن

    شیمی مدرن ۵٫۰۰/۵ (۱۰۰٫۰۰%) ۱ امتیاز ساختمان اتم : مدت ¾ قرن دانشمندان مشغول جمع آوری اطلاعات درباره ساختمان اتم بودند . مقداری از این معلومات از بررسی خواص اجسام رادیو اکتیو مانند اوارنیم حاصل شده بود . دستگاههای پرشتاب کننده ذره ها , […]




هو الکاتب


پایگاه اینترنتی دانلود رايگان كتاب تك بوك در ستاد ساماندهي سايتهاي ايراني به ثبت رسيده است و  بر طبق قوانین جمهوری اسلامی ایران فعالیت میکند و به هیچ ارگان یا سازمانی وابسته نیست و هر گونه فعالیت غیر اخلاقی و سیاسی در آن ممنوع میباشد.
این پایگاه اینترنتی هیچ مسئولیتی در قبال محتویات کتاب ها و مطالب موجود در سایت نمی پذیرد و محتویات آنها مستقیما به نویسنده آنها مربوط میشود.
در صورت مشاهده کتابی خارج از قوانین در اینجا اعلام کنید تا حذف شود(حتما نام کامل کتاب و دلیل حذف قید شود) ،  درخواستهای سلیقه ای رسیدگی نخواهد شد.
در صورتیکه شما نویسنده یا ناشر یکی از کتاب هایی هستید که به اشتباه در این پایگاه اینترنتی قرار داده شده از اینجا تقاضای حذف کتاب کنید تا بسرعت حذف شود.
كتابخانه رايگان تك كتاب
دانلود كتاب هنر نيست ، خواندن كتاب هنر است.


تمامی حقوق و مطالب سایت برای تک بوک محفوظ است و هرگونه کپی برداری بدون ذکر منبع ممنوع می باشد.


فید نقشه سایت


دانلود کتاب , دانلود کتاب اندروید , کتاب , pdf , دانلود , کتاب آموزش , دانلود رایگان کتاب

تمامی حقوق برای سایت تک بوک محفوظ میباشد

logo-samandehi